操作方法:
(1)单向免疫扩散法:
①抗体琼脂板的制备:将“凹”型模板夹于两块玻璃板之间,在玻璃板左、右、下各用铁夹1只夹紧。将上述加热融化的10g/L琼脂分装3支试管,每管14.7ml,然后移入56℃水浴中,待试管内温度降至56℃后,分别加入上述抗人IgG、IgA、IgM血清(例如其抗血清效价为1∶50,即各管分别加入0.3ml抗人IgG、IgA、IgM血清),使其最终稀释倍数符合瓶签所标单扩散效价,混匀后,分别倒入模板内(要迅速,防止琼脂凝固)。冷却后,取去上层玻璃及模板,即得平整均匀的抗体琼脂板。
②打孔:取打孔器在抗体琼脂板上相距15mm(孔中心至孔中心)打孔,用针头挑去孔内的琼脂,孔边要求圆而规整,无缺损,无毛刺。有现货供应,可供选用。
③参考血清的稀释。
A.取14支试管并编号2-15。
B.第2管加入生理盐水0.1ml,从第3管起至第15管中加生理盐水0.2ml。
C.取冻干参考血清1支(标明0.5ml),先加蒸馏水0.5ml溶解后再加生理盐水0.25ml,混匀后1∶1.5倍稀释基础液作第1管。
D.从第1管中先取0.3ml加入第2管,再取0.2ml加入第3管。
E.用0.2ml吸管从第2管内吸出0.2ml加入第4管,混匀后再吸出0.2ml加入第6管……,以此类推跳管稀释至14管。另用0.2ml吸管从第3管内吸出0.2ml加入第5管,混匀后再吸0.2ml加入第7管……,以此类推跳管稀释至15管。如此稀释后各管中参考血清稀释倍数分别为1.5、2、3、4、6、8、12、16、24、32、48、64、96、128、192。
从第1、3、5、7、9管取样作IgM标准曲线。从第4、6、8、10、12管取样作IgA标准曲线。从第7、9、11、13、15管取样作IgG标准曲线。
F.以8310参考血清为例,经如上稀释3种Ig各5管的含量与被检标本的稀释倍数见表1。
有的参考血清是以U/ml(即国际单位/ml)来表示,它与g/L的换算关系如下:
IgG:1U/ml=0.0804g/L;IgA:1U/ml=0.0142g/L;IgM:1U/ml=0.00847g/L;IgD:1U/ml=1.41mg/L。
④待检血清的稀释:取3支试管,分别标明IgG、IgA、IgM,然后依次加入生理盐水0.49ml、0.45ml、0.4ml。用微量注射器取待检血清10μl加于IgG试管中,取50μl加于IgA试管内,取100μl加于IgM试管内,混匀。待检IgG、IgA、IgM的稀释度则分别为1∶50、1∶10、1∶5。
⑤加样:取IgG、IgA、IgM不同浓度的参考血清分别在IgG、IgA、IgM抗体琼脂板上各加3孔,每孔10μl。稀释的待检血清在三块抗体琼脂板上每个标本各加2孔,每孔10μl。
⑥将加好样的抗体琼脂板先放在水平的桌面上30min左右,再移至有盖湿盒内,置37℃水箱内,IgG、IgA孵育24h,IgM孵育48h,观察结果。如沉淀环不明显,可用生理盐水浸泡1h,中间换2次生理盐水,再用5ml/L过氧乙酸浸泡10min。
⑦读取结果:可用放大器,菌落计数器或用精度0.1mm游标卡尺,准确地测量沉淀环直径,分别量出参考血清各浓度和被检血清之平均直径。
⑧绘制标准曲线:在半对数纸上以参考血清含量为横坐标,各浓度平均沉淀环(直径一孔径)2为纵坐标绘制曲线。若几个点不在一条直线上,相差较大,应查找原因后重新测定。若几个点基本在一条线上,可经统计回归方程计算后画成一条标准曲线。
⑨以待检血清的沉淀平均直径(直径-孔径)2在标准曲线中查出其浓度,再乘以稀释倍数,即为IgM、IgA、IgG结果,以g/L报告之。
(2)免疫比浊法:
①透射比浊法:
A.抗血清浓度选择:与参考品进行方阵滴定,最适稀释度的原则为:保持抗体过量,线性范围较宽,与相应Ig反应后产生浊度较高。
B.标准曲线:将Ig参考品用稀释液稀释成不同浓度:IgG 5.0、9.0、13.0、17.0、21.0g/L;IgA 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L;IgM 0.5、1.2、1.9、2.6、3.3g/L。每个稀释度设3支复管,每管25μl。加入最适稀释度抗血清,每管2.5ml。37℃水浴1h(IgG)或2h(IgA、IgM)后,用浊度计或比色计在495nm测吸光度。以Ig浓度为横坐标,其吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
C.标本检测:检测步骤与制备标准曲线相同。测IgG时,待检血清1∶40稀释;测IgA、IgM时1∶5稀释。每批试验同时制标准曲线,并设标本对照(标本加稀释液)和抗血清对照。
②终点散射比浊法:用专用比浊管加入缓冲液0.6ml、1∶36(测IgG、IgA、IgM、C3、C4等)或1∶216(测IgG)稀释样品50μl,再加入抗血清50μl,混匀后37℃水浴30min。用激光免疫比浊仪,按预测项目(如IgG或IgA)键,以空白管(不加抗血清)调零,按测定键,测定各管,即显示所测项目含量。