操作方法:
(1)免疫透射比浊法:
①标本应是及时分离的空腹血清,可密封存放在2~6℃冰箱中,1周内测定,-20℃可存放半年。
②用全自动分析仪时,应根据不同仪器设计参数,合理选择抗原抗体比例及反应时间。也可作速率法散射比浊测定CM如用Beckman比浊仪ICS或protein array system)。
③手工法所用仪器:精密光度计,具有340nm滤光片(或分光器),样品池体积以0.5ml为宜(为节省抗血清),最好用流动杯,样品稀释最好用稀释器、经校正的加样器。
④标本处理:将血清标本及质控血清各用样品稀释剂作1∶200稀释,即先作1∶20稀释(5.Oμl血清+95μl稀释剂)后,再作1∶10稀释(多余的1∶20血清作测定apoB用)。然后按表1操作。
质控同上处理。
混匀后,25~37℃放置30min,在波长340nm比浊,根据U-UB的A值,在标准曲线上读出结果。
本法批间CV<5%。
⑤校准曲线:在手工与半自动操作中每批测定均需作校准曲线,可将校准血清稀释成1∶100、1∶200、1∶300和1∶400等4种浓度,与标本同样操作,根据定值计算出每个标准管CM浓度,以浓度(X)与其相应的A值(Y)作图(用直线回归计算),基本上成直线,但在Y轴上有一定截距,所以不能用单点标准。操作准确时浓度与A值的相关系数应在0.985以上。
如有高、中、低浓度的三份校准血清时,可与标本同样操作,做三点定标,也可作五点定标(即高、中浓度的血清等量混合,及中、低浓度的血清等量混合,成为另两份校准血清)。
本法线性范围:0.4~2.5g/L。
(2)火箭电泳法:
①浇板:每板用10g/L琼脂糖10ml,沸水浴中融化,混匀,冷至50~55℃时加入CM抗血清50μl,apoB抗血清8μl(用量视抗血清效价而定),迅速混匀后倒在预置在水平台上的玻璃板上,冷后放在4℃,20min后打孔,孔在板的阴极端,孔径3mm,孔间距至少5mm,孔容量5μl。把板放入电泳槽,用滤纸搭桥。
②稀释抗原:用0.15mol/L NaCl液将校准血清稀释成1∶100,1∶150,1∶200,1∶300,及1∶400(作校准曲线之用),血清标本按1∶200稀释,放4℃冰箱不得超过3天。
③加样:在低电流状态(10mA/板)将稀释好的定值血清及标本分别吸取5μl(准确),加入琼脂糖凝胶加样孔内。每板都要做一系列标准。
④通电:稳流24mA/板,端电压6~8V/cm,以流水冷却使琼脂糖保持15℃,电泳3~4h。
⑤脱杂蛋白及制干胶膜:电泳后的琼脂糖板浸泡在0.15mol/L NaCl中30min,将胶膜托置于聚酯薄膜上,用多层滤纸在轻轻加压下吸干胶内水分,然后将滤纸、胶膜与聚酯膜三者一起自然干燥,或用热吹风器吹干,干后胶膜会自然与滤纸及聚酯膜分开。
⑥染色:将琼脂糖胶膜平铺浸泡于染色液内20~30min。
⑦脱色:用脱色液浸泡已染色的胶膜至火箭峰清晰,背景基本无色。可在水中用两片玻璃纸将胶膜夹住,晾干后可长期保存。也可以用流水浸泡脱色至背景干净。