试剂:
(1)抗原的纯化:试验需用高纯度的抗原。通常,蛋白质抗原的纯度应达到电泳分析纯,电泳后仅显示单一区带,并具有足够或完整的免疫原性。一般先经聚丙烯酰胺电泳鉴定,再用等电聚焦SDS聚丙烯酰胺双相电泳鉴定为单一区带,然后用于免疫动物和核素标记。
纯抗原因其溶液中缺乏其他蛋白质作稳定剂,或因贮存在纯离子浓度的缓冲液中,故易形成聚合物,因此在纯化抗原时需加注意。若采用聚合物抗原的标记,用于RIA中将会显著增加非特异性结合,降低测定的灵敏度。
(2)抗原的标记方法:标记用的核素有γ射线和β射线两大类。前者常用131I、125I、51Cr,后者多用3H、32P和14C。选择放射性核素首先要考虑比放射性,比放射性愈高,参与反应的抗原化学量就愈小,测定方法的灵敏度相对就愈高。核放射性和半衰期要适宜,便于使用和防护。标记后的抗原要保持其免疫原性。标记技术要简便、经济。
标记方法有直接标记和间接标记两大类,以最常用的125I为例分述如下。
①直接标记:将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上,步骤单一,操作简便,标记物的比放射性较高,但此法仅能用于标记含酪氨酸的化合物,如所含的酪氨酸残基为蛋白质的特异性和生物活性所必需,则该活性易因标记而失活。
最常用的直接标记法为氯胺T标记法(简称h-T):氯胺T是对甲基苯磺基酰胺的N氯衍生物的钠盐,在水溶液中分解形成次氯酸成为一种氧化剂。在偏碱溶液中(pH值7.5)能使带负电荷的125I离子(Na-125I)氧化成带正电荷的125I离子,借以取代蛋白质酪氨酸苯环的氢,形成二碘酪氨酸。
125I标记率的高低与抗原(蛋白质或多肽)分子中酪氨酸的含量及其在分子中的暴露程度有关。
标记方法的原则是将纯化抗原和125I加入小试管底部,继将配制的氯胺T快速冲入,混匀振荡1~2min后加入偏重亚硫酸钠终止反应。再加碘化钾溶液稀释,然后在葡聚糖G50柱上分离,分别用井型闪烁计数器测定放射性强度(脉冲数/min、cpm),前部为标记抗原峰,后部为游离125I峰。在标记抗原峰试管中加等量1%白蛋白作为稳定剂即为标记抗原液。
②间接标记:是先将125I标记在载体上,纯化后再与蛋白质或肽抗原结合,用N琥珀酰亚胺-3-[4-羟5-(125I)碘苯]丙酸盐(NSHPP)作为间接标记试剂,该试剂的N琥珀酰亚胺基与多肽游离氨基缩合为结合物,使125I标记的苯基与蛋白质的氨基结合。
本法先以氯胺T使125I接上NSHPP,由于在水溶液中它迅速水解为3-(4-羟苯基)丙酸,故在碘化反应中要尽快减少这种水解作用。这种碘标记物必须从水箱抽提到有机溶液中去,再除去有机溶剂后,使125I-NSHPP与蛋白质结合,制成125I-NSHPP-蛋白质标记物。
本法可标记缺乏酪氨酸残基的多肽,其最大优点是不损伤蛋白质的活性,能保存标记物高度的酶活性或免疫活性,适合于对不稳定的蛋白质标记,缺点是操作复杂,标记率低。
(3)标记抗原的鉴定:为保证放射免疫测定的质量,制备的标记物必需作如下鉴定:
游离放射性碘的含量 用三氯乙酸将所有蛋白质沉淀,分别测定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游离碘占总放射性碘的5%以下。标记抗原贮存过久时,可出现标记物的解离,一旦超过5%则应废弃。
免疫活性 用小量标记抗原加过量抗体,反应后分离B和F,分别测定其放射性,算出百分结合率,此值应在80%以上,值越大,表示损伤抗原越少。
放射强度 它是指单位重量抗原的放射强度,比放射性越高,测定越敏感。标记抗原的比放射性以125I的标记率或利用率表示。
(4)抗体的制备和鉴定 RIA中所用的抗体应具有高亲和力和高特异性,制备高价单相抗血清,最好以标记用的纯化抗原免疫动物,制备半抗原的抗血清,需先将半抗原与载体结合,使成免疫原,常用的载体为牛血清白蛋白。
抗血清同样也要加以严格鉴定,包括其灵敏度、亲和力和特异性。在固定量标记抗原与不同浓度的抗血清作用的条件下,测定B/F值,制得一条B/F值对不同稀释度抗血清的曲线图(图3),该曲线的直线部分上段的斜率是抗体最大亲和力的定性标志,也是灵敏度的标志。斜率越大,RIA灵敏度越高,在许多RIA反应系统中,呈最大灵敏度的抗体浓度为B/F=1。
当采用固定量的抗体(Q0)与不同浓度的抗原作用时,以B/F对B作图,所得曲线的斜率就是亲和常数(Ka)的负数(图4)。
在RIA反应系统中,测定结构相似的不同物质时,可以鉴定抗体的特异性。